前言

 

最近數年國內藥物研發(fā)風(fēng)生水起,十分火爆,而藥物研發(fā)的分析領(lǐng)域必然經(jīng)常需要開(kāi)發(fā)HPLC檢測方法, HPLC最常用的是反相色譜。我在這篇文章中將結合現有的成文理論與本人的心得體會(huì ),闡述我對反相色譜方法開(kāi)發(fā)的理解,希望對新入行的親們有所幫助。本文力求從實(shí)戰中闡述理論,在實(shí)戰中總結經(jīng)驗,使得看完本文的讀者就能對自己實(shí)際工作中的方法開(kāi)發(fā)有一個(gè)初步的構想。R-HPLC方法開(kāi)發(fā)一般包含四大塊的內容:檢測波長(cháng)、色譜柱、樣品處理、流動(dòng)相。下文將主要從這四個(gè)方面闡述在方法開(kāi)發(fā)中如何選擇上述參數。

1檢測波長(cháng)

1.1閑述

紫外檢測器是液相中最常用的檢測器,絕大部分藥物在該檢測器中有響應,所以本文僅闡述使用紫外檢測器如何確定檢測波長(cháng),其他檢測器的使用將另行說(shuō)明(隨手挖個(gè)坑)。

1.2常見(jiàn)做法

目前常見(jiàn)的做法是用選定的稀釋劑或者某個(gè)溶劑將樣品溶解,然后在紫外光譜儀中進(jìn)行全波長(cháng)掃描,得到各組分的光譜,并確定方法的檢測波長(cháng)。

很遺憾的說(shuō),上面的做法不正確。我們可以想象,當組分進(jìn)入檢測器時(shí),它是處在流動(dòng)相中的,也就是說(shuō)各組分在HPLC中的光譜表現是在流動(dòng)相中的光譜表現。紫外吸收光譜有一個(gè)術(shù)語(yǔ)叫“溶劑效應”,是指受溶劑的極性或酸堿性的影響,使溶質(zhì)吸收峰的波長(cháng)、強度和形狀發(fā)生不同程度的變化。這就意味著(zhù)如果溶劑與流動(dòng)相不一樣,則上述的光譜和各組分實(shí)際在HPLC中的光譜很可能是不一致的。比如某些易解離化合物在不同pH值的溶劑中,最大吸收波長(cháng)不一樣。

1.3如何確定檢測波長(cháng)

使用二極管陣列檢測器(開(kāi)發(fā)方法的時(shí)候首選該檢測器)按照確定的方法進(jìn)樣分析,獲得各組分的光譜圖,檢測波長(cháng)一般選擇主成份的波峰或者波谷處。因為在波峰或者波谷處較為平坦,波長(cháng)的少許偏差響應相差不大,方法在波長(cháng)這一塊的耐用性較好,而在坡上則正好相反。如果是多組分含量測定,比如復方制劑的含量測定,可以使用二極管陣列檢測器,分別調取不同組分的最大吸收波長(cháng)響應數據。

 

在有關(guān)物質(zhì)的檢測波長(cháng)選擇中,有一種常見(jiàn)做法是將各個(gè)組分的光譜圖疊在一起,選擇交叉處,因為該處的各組分響應接近,即校正因子將都接近1。這種做法本人并不贊同,因為交叉處大多出于坡上,檢測波長(cháng)的變動(dòng)將帶來(lái)響應值的巨大變化,方法的耐用性非常差,甚至可能導致各組分的響應非常不穩定。本人建議波長(cháng)選擇主峰的波峰或者波谷,因為有關(guān)物質(zhì)大部分結構與主成份類(lèi)似,光譜行為接近,如有結構與主成份相差較大,響應也相差很大,可以單獨制定控制方法(如外標法)。

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色譜柱

 

應根據進(jìn)樣量、樣品性質(zhì)、儀器狀態(tài)、其他組分和流動(dòng)相等情況選擇相應的色譜柱。

2.1進(jìn)樣量

如有關(guān)物質(zhì)方法,各組分響應較弱,為滿(mǎn)足靈敏度的要求,進(jìn)樣量較大,則需考慮色譜柱應滿(mǎn)足荷載的要求,避免進(jìn)樣量大導致的柱過(guò)載使主峰展寬變形。一般這種情況大多選用大載碳量的25*0.46cm或更大規格柱,盡可能提高柱荷載。與此相對,含量測定方法一般進(jìn)樣量較小,為減少分析時(shí)間可以選擇較短的色譜柱。

2.2樣品性質(zhì)

反相色譜使用的色譜柱大多是烷基鍵合硅膠,如C18、C8、苯基柱等。硅膠上有硅羥基,硅羥基會(huì )電離成硅氧負離子。如果供試品為堿性化合物,如鹽酸厄洛替尼,弱堿強酸鹽,則厄洛替尼除了會(huì )與鍵合相產(chǎn)生“相似相容”的反相色譜保留作用外,還會(huì )與硅氧負離子產(chǎn)生離子色譜的保留作用,即“二次保留”,導致厄洛替尼峰拖尾。

 

解決堿性化合物拖尾有兩個(gè)辦法,一個(gè)是在流動(dòng)相中加入掃尾劑,相應內容見(jiàn)“流動(dòng)相”。另一種方法是選擇“封尾(也稱(chēng)封端)”處理的色譜柱。所謂封尾,是因為鍵合相一般體積較大,C18、C8、苯基等,因空間位阻使得硅膠上硅氧負離子不能完全被鍵合,所以用小分子烷烴與硅膠上殘余的硅羥基鍵合,減少硅氧負離子的數量。本人一般在開(kāi)發(fā)堿性化合物液相方法時(shí)選擇封尾處理的色譜柱,具體封尾柱的型號見(jiàn)供應商說(shuō)明書(shū),文中就不一一列舉,畢竟他們也沒(méi)給我廣告費。

 

酸性和中性化合物選擇色譜柱不用考慮硅氧負離子的影響。

2.3儀器狀態(tài)

選擇色譜柱時(shí),還需考慮儀器是否匹配,選擇小粒徑或小口徑色譜柱,應評估儀器的最大耐受壓力是否符合要求。如選擇快速分析柱(短、小粒徑、小口徑),應考慮柱外死體積引入的峰展寬,這種情況下最好選擇同一廠(chǎng)家的儀器與色譜柱,避免接頭不匹配增加死體積。

2.4其他組分

如膠囊的溶出檢測中,使用C18柱如果發(fā)現多次檢測后主成分峰變形,一般是因為膠囊殼中存在強保留組分,可以選擇另一種保留機制的色譜柱如氰基柱或氨基柱等。不同類(lèi)型鍵合相保留機制各有不同,篇幅有限,另行說(shuō)明吧(又挖個(gè)坑)。比如苯環(huán)上的細微差別,如多了個(gè)鹵素,C18柱分不開(kāi),可以選擇苯基柱,苯基柱對于苯環(huán)上細微差別有良好的分離效果。某些組分分離效果非常差,可以考慮換一個(gè)型號的色譜柱,比如從島津的ODS-2換成安捷倫的XDB-C18,不同型號的色譜柱因為工藝的差別選擇性也是有差別的,這沒(méi)有規律,只能是通過(guò)實(shí)驗來(lái)確認適用的色譜柱。

2.5流動(dòng)相

應選擇與擬定流動(dòng)相匹配的色譜柱,增加色譜柱使用壽命。如流動(dòng)相含0.1%磷酸,就應選擇耐酸柱;反之如流動(dòng)相pH較高(>7),應選擇耐堿柱。具體哪些型號色譜柱耐酸或耐堿,見(jiàn)供應商說(shuō)明書(shū)。

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樣品處理3.1稀釋劑選擇

稀釋劑不是只把樣品溶解就可以了,需要考慮“溶劑效應”,此溶劑效應與上文紫外光譜的溶劑效應不是同一個(gè)含義(題外話(huà)GC也有溶劑效應的概念,有興趣的親可以了解一下)。溶劑效應的具體概念及詳細分析請見(jiàn)拙著(zhù)<論液相色譜的溶劑效應>,不再贅述。選擇稀釋劑時(shí),稀釋劑在滿(mǎn)足溶解供試品的前提下,應盡可能與流動(dòng)相性質(zhì)接近,在有機相比例、pH值等方面,但是一般很少選擇流動(dòng)相作為稀釋劑,因為流動(dòng)相配制較為麻煩,選擇流動(dòng)相作為稀釋劑增加了工作量;還有就是很多流動(dòng)相中含有緩沖鹽,如果選為稀釋劑,供試品溶液在進(jìn)樣器中產(chǎn)生高壓鹽析現象,固體鹽顆粒會(huì )損壞進(jìn)樣器。稀釋劑一般選擇同初始比例的有機相-水系統。如果不溶解,需要用其他溶劑溶解的話(huà),最好使用前述的有機相水系統稀釋10倍以上。絕不能直接用其他溶劑溶解,然后進(jìn)樣分析,因為很可能產(chǎn)生溶劑效應和樣品析出堵塞儀器。易解離化合物可以在稀釋劑中加入鹽酸或者氫氧化鈉助溶。

補充說(shuō)明,一般保留時(shí)間短的組分容易出現溶劑效應,減少溶劑效應可以采取的措施有減少進(jìn)樣量、增強保留、改變稀釋劑、優(yōu)化流動(dòng)相。優(yōu)化流動(dòng)相是因為溶劑效應是稀釋劑和流動(dòng)相相差性質(zhì)較大導致的結果,也就是二者的相互作用導致的,所以可以通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相來(lái)消除溶劑效應。

3.2供試品濃度

有關(guān)物質(zhì)方法應考慮方法的靈敏度,一般主成份峰的響應值應不低于1000,并將供試品溶液稀釋一萬(wàn)倍后信噪比應不低于10。含量測定方法應考慮主成分峰在線(xiàn)性范圍內,不能分離的雜質(zhì)峰在規定濃度下應可以忽略不計。

3.3供試品處理方法

如果供試品的處理方法畢竟特殊,還需要在質(zhì)量標準中規定特殊的處理方法,則需要對供試品的處理進(jìn)行相應的研究。比如片劑的含量測定,直接投片、研成細粉、除去包衣再研成細粉、超聲及時(shí)間、震搖及時(shí)間、濾膜吸附、離心等等。這些處理方法都需要進(jìn)行相應的研究,以保證樣品的處理符合檢測的需要。比如說(shuō)片劑含量實(shí)際是100%,而檢測結果卻是90%,色譜條件沒(méi)有問(wèn)題,問(wèn)題出在供試品處理時(shí)提取不完全。

3.4 衍生化

某些情況下樣品需要衍生化才能滿(mǎn)足質(zhì)量控制的要求,如保留太弱、沒(méi)有響應、異構體無(wú)法分離等。內容太多,篇幅有限,就不在本文中說(shuō)明了(再挖個(gè)坑)

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流動(dòng)相4.1流動(dòng)相的種類(lèi)

反相色譜的流動(dòng)相主要是兩大類(lèi):水相和有機相。水相主要分為兩種:純水和緩沖鹽;有機相最常用的是乙腈和甲醇,其他還有乙醇、四氫呋喃、異丙醇等。

 

4.1.1 什么情況下用純凈水

 

供試品和主要雜質(zhì)都是中性化合物(即不會(huì )電離或者不易電離)的情況下,流動(dòng)相可以用純水-有機相系統,這種情況不多,所以大多數都用了緩沖鹽。

 

4.1.2  什么情況下用緩沖鹽

 

供試品或主要雜質(zhì)為易解離化合物,如鹽酸厄洛替尼、帕瑞昔布鈉等一看就是能電離的,根本不用考慮純水,流動(dòng)相需要使用緩沖鹽。易解離化合物的相關(guān)內容見(jiàn)<易解離化合物的pKa、離子型、分子型及其HPLC保留特征>,緩沖鹽使用的詳細內容見(jiàn)拙著(zhù)<方法開(kāi)發(fā)緩沖鹽選擇指導原則>,本文不再贅述。

 

 

4.1.3 如何選擇有機相

 

一般是根據組分的分離情況、截止波長(cháng)、壓力等因素選擇有機相。比如甲醇和乙腈,二者的性質(zhì)不一樣,甲醇有氫鍵,乙腈是偶極矩,在組分間的選擇性不一樣,甲醇分不開(kāi)的組分可能乙腈能分開(kāi),乙腈分不開(kāi)的組分可能甲醇能分開(kāi)。低波長(cháng)下如205nm一般應選擇乙腈,乙腈的截止波長(cháng)較低,在低波長(cháng)下基線(xiàn)較平坦,此時(shí)不應選擇乙醇、四氫呋喃等溶劑。乙腈作為流動(dòng)相產(chǎn)生的壓力一般也小于甲醇、乙醇等溶劑,如果超過(guò)系統允許最大壓力的風(fēng)險較高,應選擇乙腈作為流動(dòng)相。流動(dòng)相常用有機溶劑截止波長(cháng)親們需要去了解,方法選定的波長(cháng)應遠大于流動(dòng)相的截止波長(cháng)。截止波長(cháng)這個(gè)概念都可以寫(xiě)一篇文章了(又見(jiàn)坑)。

4.2 如何確定流動(dòng)相比例和梯度

有兩種做法,一種是設置一個(gè)60分鐘有機相比例從5%到100%的梯度,并根據此梯度下各組分的保留的情況決定下一步的優(yōu)化策略。本人一般不這么做,我在實(shí)際工作發(fā)現這么做耗時(shí)太久,我的做法是等度逐漸降低有機相比例確定各組分的保留情況,并根據等度研究的結果確定是否采用梯度及梯度情況。

 

舉例如下:需要建立一個(gè)有關(guān)物質(zhì)檢測方法,有A、B、C、D、E5個(gè)組分,極性依次增大(分析人員應能做到看化合物結構式就能判斷其極性的相對大小,這對有機化學(xué)的功底有一定的要求),即在反相色譜中保留依次減小。我首先用80%有機相分析A, k值為1;分析B,無(wú)保留。則CDE三個(gè)保留更弱的組分在該條件下沒(méi)有必要進(jìn)樣。

 

因為B無(wú)保留,所以有機相應直接減少20%,改變條件為60%有機相,分析B,k值為0.5;此時(shí)需要注意一個(gè)反相色譜的一個(gè)規則“三倍規則”,即有機相比例減少10%,保留值增加2-3倍。該規則可以準確預測中性化合物隨有機相比例變化的保留情況,易解離化合物因為保留較為復雜,可能會(huì )有偏差。改變條件為50%有機相,分析C^分析E的時(shí)候有機相比例30%,k值為1。

 

上述的研究就讓我們對5個(gè)組分的保留有了一個(gè)直觀(guān)的了解,必須走梯度,梯度下限應不大于30%,上限應不小于80%,我們可以設置梯度為25分鐘從30%升到80%保留5分鐘,然后確定各組分在該梯度下的分離情況,必要的話(huà)進(jìn)行調整。這么做的好處是速度快,一般來(lái)說(shuō)順利的話(huà)一個(gè)上午可以完成各組分等度研究,下午確定梯度分離情況,一天完成一個(gè)有關(guān)物質(zhì)方法的開(kāi)發(fā);另一個(gè)好處就是在等度研究時(shí)就可以確認各組分分離情況了,很快就能發(fā)現難分離組分。

4.3添加劑

  4.3.1  掃尾劑

 

上文說(shuō)到的堿性化合物因硅氧負離子的二次保留導致的拖尾,常用二乙胺、三乙胺等小分子有機胺類(lèi)化合物飽和硅氧負離子,使其不能與目標化合物產(chǎn)生二次保留。二乙胺、三乙胺一般被稱(chēng)為“掃尾劑”。不建議在流動(dòng)相中使用掃尾劑,因為使用之后流動(dòng)相容易變質(zhì),噪音變大,且易出鬼峰。一般情況下使用封尾處理的色譜柱可以達到相同的效果。

    4.3.2  離子對試劑

如供試品中有強離子化傾向的組分,保留非常弱,為了增強其保留,可以在流動(dòng)相中加入相應的離子對試劑如氫氧化四丁基銨、十二烷基硫酸鈉等。它的原理就是流動(dòng)相相中的離子對試劑的非極性基團與反相鍵合相結合,其離子化基團與強離子化組分陰陽(yáng)離子相互吸引,增強強離子化組分的保留。如小分子強堿性化合物,如在流動(dòng)相中加入十二烷基硫酸鈉,十二烷基與色譜柱的C18結合,硫酸陰離子與該化合物形成離子間的保留,極大增強了該化合物的保留。

 

離子對色譜中即有反相色譜的保留機制,又有離子色譜的保留機制。它的保留呈現以下的規律:強離子化組分的保留隨離子對試劑的濃度增加而增加,隨pH值的變化而變化,即可以通過(guò)調節離子對試劑的濃度和pH值改變強離子化組分的保留。其他中性組分隨離子對試劑的濃度增加保留可能略有減少,反離子組分的保留極大減少。

 

加入離子對試劑的缺點(diǎn)是流動(dòng)相容易變質(zhì),污染色譜柱,平衡時(shí)間非常長(cháng),基線(xiàn)較差等。所以除非有上述存在強離子化傾向的組分,一般我不愿意使用離子對試劑。

 

   4.3.3 手性添加劑

 

可以在流動(dòng)相中加入手性添加劑實(shí)現在反相色譜中分離手性異構體,這又是一個(gè)很大的話(huà)題,可以專(zhuān)門(mén)寫(xiě)一篇文章說(shuō)說(shuō)這個(gè)(還挖坑,你們會(huì )不會(huì )罵我?)。當然這是比較冷門(mén)的做法,有興趣可以了解,一般不大用。使用手性色譜柱分析手性異構體是最常用的方法。

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其他

 

方法開(kāi)發(fā)時(shí)應選擇二極管陣列檢測器,在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中考察各組分的峰純度,獲得各組分的光譜圖。

 

方法確定后應進(jìn)行初步的驗證,如降解試驗,確認降解產(chǎn)物是否能夠分開(kāi)。降解試驗的做法見(jiàn)拙著(zhù)<分析方法學(xué)驗證技巧與重點(diǎn)>。

 

方法開(kāi)發(fā)是一個(gè)持續的過(guò)程,應在工作中持續評估方法的有效性和合理性。如本人曾經(jīng)有一個(gè)項目在很后期才發(fā)現片劑經(jīng)研磨后含量測定的結果低了3個(gè)點(diǎn),然后將供試品處理改成直接投片。

6后述

方法開(kāi)發(fā)是一個(gè)很大的話(huà)題,我本沒(méi)想寫(xiě)這么多,但是寫(xiě)著(zhù)寫(xiě)著(zhù)就發(fā)現根本停不下來(lái),而且還有很多東西沒(méi)說(shuō)明白,還挖了很多坑等以后填。其實(shí)這也說(shuō)明做一個(gè)研發(fā)分析人員需要非常寬和深的知識積累,我們應該持續學(xué)習,不能懈怠。